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F-TOP10

2016-4-17

F-TOP10快速轉化感受態細胞

產品說明書 


產品規格(CAT#: DF1010)

F-TOP10:                                                           100μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                           10μl

保存條件(保質期):                                   -80℃(6個月) 


基因型

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139 Δ(ara-leu)7697 galgalrpsL (StrR)endA1 nup


產品說明

TOP10菌株來源于MC1061,是目前實驗室最常用的感受態細胞之一,基因型與DH10B高度類似 (DH10B為galE15型,而TOP10為galU型)。TOP10生長速度快,37℃,10小時可見克隆。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。可用于構建克隆,藍白斑篩選等實驗。


F-TOP10感受態細胞經特殊工藝制作,無需42℃熱激,37℃孵育步驟,只需冰浴,10min內完成轉化、涂板操作,pUC19質粒檢測轉化效率可達1~5×10cfu/μg DNA。


快速轉化操作方法 (10min)

1. 提前15分鐘將用到的篩選培養基平板拿到37℃預熱

2. F-TOP10感受態細胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,5分鐘后待菌塊融化,加入目的DNA(質粒或連接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻,,冰中靜置5分鐘。

3. 用200μl槍將感受態細胞-DNA混合物轉移到已經37℃預熱的2YT或LB培養基上。

4. 將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。如果進行藍白斑篩選操作,將平板放37℃培養至少13 h。


快速熱激轉化操作方法 

(25min,可提高轉化效率)

1. F- TOP10感受態細胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,5分鐘后待菌塊融化,加入目的DNA (質粒或連接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻,,冰中靜置5分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒,迅速放回冰上并靜置2分鐘 (晃動會降低轉化效率)。加入700 μl 不含抗生素的LB,37℃,200 rpm 復蘇10分鐘,涂板 (均勻,表面無水漬)。

3. 將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。如果進行藍白斑篩選操作,將平板放37℃培養至少15h。


注意事項

1. F-TOP10快速轉化感受態細胞也可進行熱激操作,對于>7 kb質粒的構建,為了提高轉化效率可按以下步驟操作:F-TOP10感受態細胞從-80℃拿出,插入冰中,5分鐘后,加入目的DNA并用手撥打EP管底輕輕混勻,冰中靜置20分鐘。42℃水浴熱激45秒,迅速放回冰中靜置2分鐘。加入700 μl LB,37℃,200 rpm復蘇30分鐘,涂板。

2. 感受態細胞最好在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內加入目標DNA,不可在冰中放置時間過長,長時間存放會降低轉化效率,混入目的DNA時應輕柔操作。

3. F- TOP10快速轉化感受態細胞涂氨芐/羧芐青霉素抗性平板時效率較高,若涂卡那霉素或其他抗生素平板,轉化效率下降(因無孵育步驟,卡那霉素等對菌體毒性較大)。若要提高卡那霉素或其他抗性質粒的轉化效率,可按熱激轉化操作,增加孵育步驟。






說明書下載

F-TOP10快速轉化感受態細胞產品說明書


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