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R5421

2018-1-2

R5421 Chemically Competent Cell

產品說明書 


 

產品規格 (CAT#: YC1080)

R5421 :                    100μl/支      保存: -80℃(3個月)

pGADT7  :                     10μl       保存:-80℃(12個月)

Carrier DNA :             100μl       保存:-20℃(12個月)

PEG/LiAC:                   5ml        保存:    4℃(12個月) 


基因型

MATα ura3-52 leu2 trk1Δ his3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK64


產品說明

R5421釀酒酵母菌株為K+/鉀離子缺陷型菌株,在文獻中也稱為CY162,MATα型,多用于K+/鉀離子轉運蛋白的鑒定試驗中,也可用于K+/鉀離子通道或鈉鉀離子泵的鑒定試驗。Transformation marker為:ura3leu2,該菌株可以在含有100mM KCl的培養基中國正常生長,在含有5-10mM KCl的培養基中生長緩慢,當培養基中KCl濃度低于0.5mM,R5421(CY162)細胞停止生長。R5421感受態細胞經特殊工藝制作,-80℃可保存三個月,pGADT7質粒檢測轉化效率>103 cfu/μg DNA。

 

操作方法

1. Carrier DNA 在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態,步驟如下:Carrier DNA 放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min,再次放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min以上。

2. 取100 μl冰上融化的R5421感受態細胞,依次加入預冷的目的質粒0.5-3 μg,Carrier DNA10 μl,PEG/LiAc 500 μl并吸打幾次混勻,30℃水浴30 min (15 min時翻轉6-8次混勻)。

3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉6-8次混勻)。

4. 5000 rpm離心 40 s棄上清,ddH2O 400 μl 重懸,離心 30s棄上清。

5. ddH2O 50 μl重懸,涂板,29℃培養48-96 h。


注意事項

1. 感受態細胞最好在冰上融化。

2. 轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

3. 同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。

4. R5421酵母菌株對高溫敏感,最適生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉化效率呈指數下降。

5. 菌落變粉不是污染,是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后,平板上的Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。

6. 酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢,培養基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48 h培養可見直徑1 mm克隆;涂SD單缺平板29℃,48-60 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培養可見直徑1 mm克隆。




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