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Y1HGold

2015-8-27

Y1HGold Chemically Competent Cell

產品說明書



產品規格 (CAT#: YC1001)

Y1HGold :               100μl/支      保存: -80℃(3個月)

pGADT7  :                     10μl       保存:-80℃(12個月)

Carrier DNA :             100μl       保存:-20℃(12個月)

PEG/LiAC:                   5ml        保存:    4℃(12個月)


基因型

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met-, MEL1


產品說明

Y1HGold菌株是Clontech公司開發的GAL4-AbA酵母單雜系統用菌株,MATα型,可直接轉化質粒進行篩庫試驗。Transformation marker為:ura3leu2;報告基因為:AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母單雜系統需要兩種質粒配套使用:pAbAi 和PGADT7。質粒pAbAi的篩選標志為URA,用于表達 pBait-AbAi construct (1~3個bait DNA序列重復串聯后克隆到pAbAi中);質粒pGADT7的篩選標志為LEU,用于表達AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4-AbA酵母單雜系統原理:Aureobasidin A (AbA)是一種環酯肽抗生素,在低濃度 (0.1-0.2 μg/ml)下即可對酵母產生毒性。基因組中整合了pBait-AbAi 的酵母菌株 (Bait-Reporter Yeast Strains),當獵物蛋白 (Prey)結合到誘餌序列 (Bait DNA)上,GAL4 AD就會激活AbAr的表達,從而能夠在含有抗生素AbA 的培養基上生長。AbAr與營養缺陷報告基因相比具有更低背景的優點,可以降低酵母單雜假陽性發生的概率。Y1HGold感受態細胞經特殊工藝制作,-80℃可保存三個月,pGADT7質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。


操作方法

1. pBait-AbAi質粒5μgBstBI BbsI酶切1小時,回收。

2. 100 μl冰上融化的Y1HGold感受態細胞,依次加入預冷的線性pBait-AbAi質粒1-5 μg(體積不高于15 μl),Carrier DNA (95-1005 min,快速冰浴,重復一次) 10 μlPEG/LiAc 500 μl并吸打幾次混勻,30度水浴30 min (15 min時翻轉6-8次混勻)

3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉6-8次混勻)

4. 5000 rpm離心 40 s棄上清,ddH2O 400 μl 重懸,離心 30s棄上清。

4. ddH2O 50 μl重懸,涂SD/-Ura平板,29℃培養72 h

5. 挑取5-10個克隆,用PCR方法確定pBait-AbAi 整合到Y1HGold 基因組中,PCR 陽性菌株在SD/-Ura平板劃線,29℃培養72 h4℃保存,此菌株即是Y1HGold[Bait/AbAi] 菌株。

 

注意事項

1. 感受態細胞最好在冰上融化。

2. 轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

3. 同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。

4. Y1HGold酵母菌株對高溫敏感,最適生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉化效率呈指數下降。

5. 菌落變粉不是污染,是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后,平板上的Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。

6. 酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢,培養基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48 h培養可見直徑1 mm克隆;涂SD單缺平板29℃,48-60 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90 h培養可見直徑1 mm克隆。




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